Co-circulación viral de Dengue y Chikungunya en mosquitos Aedes aegypti infectados naturalmente en Venezuela / Dengue and Chikungunya viral co-circulation in naturally infected Aedes aegypti mosquitoes in Venezuela

Para detectar los arbovirus Dengue (DENV), Zika (ZIKV) y Chikungunya (CHIKV) en mosquitos Aedes aegypti (Ae. aegypti), se evaluaron dos municipios del estado Aragua, Francisco Linares Alcántara (FLA) y Mario Briceño Iragorry (MBI). Se capturaron 163 mosquitos en MBI y 105 en FLA con aspirador de espalda. Estos se agruparon (2-9 mosquitos) para la extracción de ARN y análisis mediante RT-PCR específica para cada virus. Se calcularon, Tasa Mínima de Infección (TMI) y Estimación de Máxima Verosimilitud (EMV). Los resultados evidenciaron co-infección de mosquitos por DENV-3 y CHIKV en FLA, y solo por CHIKV en MBI. Las TMI en MBI fueron para DENV (0%), CHIKV (0,61%), en FLA los valores para DENV y CHIKV, fueron 1,90% y 2,86%; respectivamente. Las EMV fueron en MBI igual a 0% para DENV y 0,63% para CHIKV, en FLA DENV (0,19%) y CHIKV (1,53%). Se comprobó la infección natural de Ae. aegypti con DENV y CHIKV, específicamente la co-circulación viral de DENV-3 y CHIKV en FLA, en MBI solo fue detectado CHIKV. La ausencia de detección de ZIKV probablemente se debió a interferencia viral. Los resultados indican la relevancia de incorporar a las prácticas convencionales de control vectorial, la detección específica de virus en zonas endemo-epidémicas durante todo el año, lo que favorecería las intervenciones y puesta en marcha de estrategias de control y prevención efectivas para limitar la permanente transmisión viral(AU)

To detect Dengue (DENV), Zika (ZIKV) and Chikungunya (CHIKV) in mosquitoes (Ae. aegypti) we evaluated two municipalities in Aragua State, Francisco Linares Alcántara (FLA) and Mario BriceñoIragorry (MBI). We captured 163 mosquitoes in MBI and 105 in FLA using Back Aspirator. The mosquitoes were grouped (2-9 mosquitoes per tube) for RNA extraction and typification by RT-PCR. We calculated Minimal Infection Rate (MIR) and Maximum Likelihood Estimation (MLE). The results showed co-infection by DENV-3 and CHIKV in FLA, and CHIKV in MBI. The MIR was to DENV 0% and 0.61% to CHIKV in MBI, whiles in FLA the values were 1.90% and 2.86% to DENV y CHIKV, respectively. The EMV were in MBI to DENV 0% and 0.63% to CHIKV, in the case of FLA DENV value was 0.19% and CHIKV 1.53%. We showed the natural infection of Ae. aegypti mosquitoes with DENV-3 and CHIKV in FLA and CHIKV in MBI. The absent of detection to ZIKV was probably due to viral interference. The results showed the relevance of incorporation of these techniques to conventional practices about vectorial control, specifically detection of viruses in endemic and epidemic regions during all year, because these practices could contribute to the effective interventions to control and prevention the viral transmission(AU)

Evidencia de Chlamydia no psittaci en psitácidos en cautiverio de Venezuela / Evidence of non-psittaci Chlamydia in parrots in captivity in Venezuela / Evidência de Chlamydia não psittaci em psitacídeos em cativeiro na Venezuela

Resumen Chlamydia psittaci (Cp) es una bacteria intracelular obligada causante de la clamidiosis aviar, capaz de infectar a más de 460 especies de aves. Sin embargo, desde 2008 han sido identificadas otras especies chlamydiales en aves de vida libre y en cautiverio. El presente estudio tuvo como objetivo la identificación de un segmento del gen 16s ADNr de Cp a través de la reacción en cadena de la polimerasa anidada en dos psitácidos del género Ara ararauna y Ara chloropterus de un parque zoológico de Venezuela. Los resultados revelaron que las aves no poseían ADN compatible con Cp, pero sí para la familia Chlamydiaceae. En este sentido se aporta evidencia de la presencia de otra posible especie chlamydial en las Ara muestreadas en estado portador asintomático. Dichas aves provenían de decomisos y se desconocía su origen. Estos factores favorecen la infección por otra especie de Chlamydia. Si bien los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) obtenidos no fueron secuenciados, existen altas probabilidades de ser una Chlamydia no psittaci debido a que un elevado número de reportes a escala mundial afirman la capacidad de transmisión del resto de las especies en aves. En este sentido es necesaria la notificación de los hallazgos chlamydiales para el estudio de su capacidad patogénica en nuevos reservorios, riesgo zoonótico y la protección de la fauna silvestre y en cautiverio, principalmente la que se encuentra en riesgo de extinción.

Abstract Chlamydia psittaci (Cp) is an obligate intracellular bacterium that causes avian chlamydiosis, capable of infecting more than 460 bird species. However, since 2008, other chlamydial species have been identified in free-living and captive birds. This study aimed to identify a segment of the 16s rDNA gene of Cp using nested polymerase chain reaction in two Psittacidae birds of the genus Ara ararauna and Ara chloropterus from a zoo in Venezuela. The results revealed that these birds did not have DNA compatible with Cp, but they did have for the Chlamydiaceae family. Thus, the paper evidences the presence of another possible chlamydial species in the sampled Ara in an asymptomatic carrier state. These birds were confiscated and their origin was unknown. These factors favor infection by another species of Chlamydia. Although the resulting polymerase chain reaction (PCR) products were not sequenced, there is a high probability of being a non-psittaci Chlamydia, because a large number of reports on a global scale affirm the transmission capacity of the rest of the species in birds. In this sense, it is necessary to report chlamydial findings in order to study their pathogenic capacity in new reservoirs, zoonotic risk, and the protection of wildlife and animals in captivity, mainly those at risk of extinction.

Resumo Chlamydia psittaci (Cp) é uma bactéria intracelular obrigada causadora da clamidiose aviar, capaz de infectar a mais de 460 espécies de aves. Entretanto, desde 2008 foram identificadas outras espécies chlamydiais em aves de vida livre e em cativeiro. O presente estudo teve como objetivo a identificação de um segmento do gene 16s ADNr de Cp através da reação em cadeia da polimerase aninhados em dois psitacídeos do género Ara ararauna e Ara chloropterus de um parque zoológico da Venezuela. Os resultados revelaram que as aves não possuíam DNA compatível com Cp, mas sim para a família Chlamydiaceae. Neste sentido se aponta evidência da presença de outra possível espécie chlamydial nas Ara amostradas em estado portador assintomático. Tais aves provinham de apreensões e se desconhecia sua origem. Estes fatores favorecem a infecção por outra espécie de Chlamydia. Ainda que os produtos de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) obtidos não foram sequenciados, existem altas probabilidades de ser uma Chlamydia não psittaci devido a que um elevado número de relatos em escala mundial afirma a capacidade de transmissão do resto das espécies em aves. Neste sentido é necessária a notificação das descobertas chlamydiais para o estudo de sua capacidade patogênica em novos reservatórios risco zoonótico e a proteção da fauna silvestre e em cativeiro, principalmente a que se encontra em risco de extinção.

Chlamydia psittaci EN AVES PSITACIDAS EN DOS PARQUES ZOOLÓGICOS DE VENEZUELA / Chlamydia psittaci in Psitacines Birds in Two Zoological Parks of Venezuela

RESUMEN La determinación de Chlamydia psittaci (Cp) en aves psitácidas en parques zoológicos de Venezuela representa una estrategia de conservación y preservación para este grupo de aves, donde múltiples especies se encuentran amenazadas de extinción y otras han perdido su capacidad de reincorporación a su hábitat natural. A través de la reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR) fue amplificada la subunidad 16S del ADNr de Cp en 50 muestras de hisopado cloacal de aves psitácidas, reportando una frecuencia de 62 %. El trabajo fue realizado en el Parque Zoológico Las Delicias (PZD) 8 % y el Aquarium de Valencia (AV) 54 %. La elevada frecuencia fue asociada a un genotipo de baja concentración y virulencia debido a la ausencia de signos clínicos de clamidiosis aviar. Estos resultados demuestran la necesidad de promover la detección de Cp, principalmente para el AV que actúa como centro de recepción de ejemplares de decomiso, y, al igual que el PZD, poseen otras especies vulnerables a la extinción con riesgo de infección a Cp.

ABSTRACT The determination of Chlamydia psittaci (Cp) in psittacida birds in zoological parks in Venezuela represents a strategy of conservation and preservation for this group of birds, where multiple species are threatened with extinction and others have lost their capacity of reincorporation to their natural habitat. Through the nested polymerase chain reaction (PCR) the 16S subunit of Cp DNAr was amplified in 50 cloacal swab samples from psittacine birds, reporting a frequency of 62 %. The work was carried out in the Zoo Park Las Delicias (PZD) 8% and the Aquarium of Valencia (AV) 54%. The high frequency was associated with a genotype of low concentration and virulence due to the absence of clinical signs of avian chlamydiosis. These results demonstrate the need to promote the detection of Cp, mainly for the AV that acts as a center of reception of specimens of confiscation, and, like the PZD, have other species vulnerable to extinction with risk of infection to Cp.

Clonación de secuencias de alfavirus y flavivirus para su uso como controles positivos en el diagnóstico molecular / Cloning alphavirus and flavivirus sequences for use as positive controls in molecular diagnostics

RESUMEN El objetivo de la investigación fue obtener controles positivos para la validación de técnicas moleculares (RT-PCR) utilizadas en diagnóstico e investigación de infecciones virales. A partir de cepas de CHIKV, Zika, DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, se extrajeron ARN virales para obtener por RT-PCR los ADN complementarios (ADNc) de las secuencias nsP4 (CHIKV), NS5 (virus Zika), C/prM-M y 5´UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) que fueron clonados en pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias, de las cuales se extrajo el ADN plasmídico para la verificación de la clonación de los fragmentos. Se logró la clonación de ADNc correspondientes a nsP4, NS5, C/prM-M y 5´UTR-C de los distintos agentes virales. En conclusión se obtuvieron los plásmidos recombinantes con cada una de las secuencias especificadas para su posterior valoración como controles positivos en técnicas moleculares, evitando el uso de cultivos celulares que pueden resultar costosos, laboriosos y potencialmente peligrosos.

ABSTRACT The purpose of the study was to obtain a positive control to validate molecular techniques (reverse transcription- polymerase chain reaction [RT-PCR]) used in the diagnosis and research of viral infections. From strains of Chikungunya virus (CHIKV), Zika virus, and Dengue virus (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, and DENV-4) viral RNAs were extracted to obtain complementary DNA using RT-PCR from the nsP4 (CHIKV), NS5 (Zika virus), C/prM-M, and 5′UTR-C (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4) sequences, which were cloned into pGEM®-T Easy. Cloning was confirmed through colony PCR, from which plasmid DNA was extracted for fragment cloning verification. Cloning of cDNA corresponding to nsP4, NS5, C/prM-M, and 5′UTR-C of the different viral agents was achieved. In conclusion, recombinant plasmids were obtained with each of the sequences specified for further assessment as positive controls in molecular techniques in an effort to avoid the use of cell cultures, which can be costly, time-consuming, and potentially dangerous.

Incidencia de infecciones sintomáticas y asintomáticas por virus dengue en Maracay, Venezuela: 2006-2007 / Incidence of symptomatic and asymptomatic dengue virus infections in Maracay, Venezuela: 2006-2007

Con el objetivo de estimar las tasas de incidencia de infecciones sintomáticas y asintomáticas por virus dengue (DENV) durante un año (octubre 2006-septiembre 2007) en cuatro barrios de Maracay (Venezuela) se realizó un estudio prospectivo consistente de visitas domiciliarias, tres veces por semana, para detectar casos de dengue y de encuestas serológicas semestrales para determinar infecciones asintomáticas probables por DENV. Los sujetos de estudio pertenecían a una cohorte de 2663 personas ≥5 años de edad. El diagnóstico confirmatorio de DENV se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Las pruebas serológicas se realizaron mediante el ensayo inmunoenzimático de captura de IgM anti-dengue (MAC-ELISA). Los resultados determinaron tasas de incidencia de 5,7 y 18,6 por 100 000 personas/día (p/d) para las infecciones sintomáticas y asintomáticas, respectivamente. La tasa de incidencia de las infecciones sintomáticas observada en las personas <15 años de edad fue significativamente mayor que la encontrada en los sujetos ≥15 años (15,8 versus 2,9 por 100 000 p/d). Por otro lado, las tasas de incidencia de las infecciones asintomáticas en ambos grupos de edad fueron similares (17,3 y 18,9 por 100 000 p/d, respectivamente). Se detectaron los cuatro serotipos del DENV en tres de los barrios estudiados. Se observó que la edad y la hiperendemicidad fueron probablemente los factores que más contribuyeron a la incidencia del dengue en los cuatro barrios investigados. Seguramente, las infecciones asintomáticas contribuyeron a incrementar la transmisión viral en el área de estudio.

The incidence rates of symptomatic and asymptomatic dengue virus (DENV) infections in four "barrios" of Maracay, Venezuela, during one-year (October 2006-September 2007) were estimated. A prospective study consisting of house visits three-times a week to detect dengue cases, and semiannual serological surveys to determine probable asymptomatic dengue virus (DENV) infections was conducted. The study subjects belonged to a cohort of 2,663 people ≥5 year-old. Confirmatory diagnosis of DENV infections was carried out by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Serological surveys were performed by anti-dengue IgM-capture immunoassay (MAC-ELISA). The results showed that the incidence rates for symptomatic and asymptomatic infections were determined to be 5.7 and 18.6 per 100,000 persons/day (p/d), respectively. The incidence rate of symptomatic infections was significantly higher in persons <15 year-old than that found in subjects ≥15 years (15.8 versus 2.9 per 100,000 p/d). On the other hand, the incidence rates of asymptomatic infections in both age groups were similar (17.3 and 18.9 per 100,000 p/d, respectively). All four DENV serotypes were detected in three of the four "barrios" studied. Finally, age and hyperendemicity were probably the contributing factors to the incidence of dengue in the four "barrios" investigated. Surely, the asymptomatic infections contributed to increase the viral transmission in the study area.

Diagnóstico de laboratorio de infecciones por el virus dengue en el estado Aragua Venezuela: octubre 1997-diciembre 1998 / Laboratory diagnosis of dengue virus infections in Aragua state Venezuela: october 1997-december 1998

La eficacia de un sistema de vigilancia epidemiológica proactivo para predecir epidemias de dengue de la capacidad del laboratorio para detectar tempranamente la circulación viral. Este estudio muestra los resultados de la vigilancia virológica del dengue, realizada en el estado Aragua (Venezuela) desde octubre 1997 hasta diciembre 1998. Se evluaron 547 sueros de pacientes sospechosos de dengue mediante las técnicas de aislamiento viral y serotipicación por inmunofluorescencia (AVSI), reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), inmunoensayo enzimático de captura de IgM anti-dengue (MAC-ELISA) e inhibición de la hemaglutinación (IHA). De los sueros examinados, 97,4 por ciento resultaron positivos a por lo menos una técnica; de estos, 60,4 por ciento fueron clasificados como casos confirmados (virológicamente positivos) y 39,6 por ciento como casos probables (virológicamente negativos, serológicamente positivos). Aunque la gran mayoría de los casos positivos ocurrieron en los períodos epidémicos de 1997 y 1998, el incremento paulatino de las tasas de serotipos entre ambos períodos sugería la llegada de la epidemia de 1998. Se detectaron pacientes infectados con virus Den-1 (51,2 por ciento), Den-2 (37,9 por ciento), Den-4 (10,6 por ciento), y una infección mixta por Den-2 y Den-4 (0,3 por ciento). Se confirma la hiperdemicidad del dengue (co-circulación de Den-1, Den-2 y Den-4) en el estado Aragua, conjuntamente con la detección de pocos pasos (6,5 por ciento) de fiebre hemorrágica de dengue/síndrome de choque por dengue (FHD/SCD); 38,1 por ciento de estos casos ocurrieron en pacientes con infecciones secundarias. El alto porcentaje (85,7 por ciento) de casos de FHD/SCD infectados con el virus Den-2 apoya la reportada virulencia de este serotipo

Comportamiento biológico de 3 cepas del virus dengue-2 en 2 líneas celulares de mosquitos / Biological behavior of 3 strains of the dengue-2 virus in 2 cell lines of mosquitoes

Strains A-15 (isolated in Cuba, 1981), Jamaica (isolated in Jamaica, 1981) and Nueva Guinea "C" (standard) from dengue-2 virus were compared according to the time of appearance of the cytopathic effect (CPE), to the time of appearance of specific fluorescence and to the kynetics of viral multiplication on being innoculated in the cell lines AP-61 (Aedes pseudoscutellaris) and C6/36 HT (Aedes albopictus). The results showed that the CPE of highest intensity and earliest appearance was for A-15, followed by Jamaica and Nueva Guinea "C" (NGC). AP-61 seems to favor the CPE of Jamaica with respect to that of the same strain in C6/36 HT. The fluorescence was earlier for Jamaica and A-15 and more intensive for the latter, whereas NGC manifested late. This behaviour was similar in the 2 cellular systems. The greatest titres during the kinetics of viral multiplication were obtained from A-15 in both lines, although in AP-61 they tend to be equal from the 4th day on. The strain A-15 showed a particular behaviour of these biological properties on comparing them with the other strains under study, which may be related to changes found in its neucleotide sequence.

Estudio de algunas propiedades biológicas de 3 cepas de dengue 2 con diferencias en sus secuencias nucleotídicas / Study of various biological properties of 3 strains of dengue 2 with differences in their nucleotide sequences

Some biological properties of Dengue-2 strains such as A-15 (isolated in Cuba in 1981); Jamaica (isolated in Jamaica in 1981) and New Guinea "C" (NG"C") standard strain differing in their nucleotide sequences were studied. The results showed that the cytopathic effect in C6/36 HT cell line occurred earlier in A-15 strain and that fluorescence was first detected in Jamaica and A-15 strains. This seems to indicate that rapid detection of strains does not have any relation to neither their history of passage nor the original isolation system. A-15 and NG"C" strains exhibited an heterogeneous pattern formed by big and small plaques but average size of plaques in NG"C" was lower whereas Jamaica showed only small plaques. The most neurovirulent strain in mice was NG"G" followed by A-15 whereas Jamaica was not neurovirulent at all. These results indicate that A-15 has a different biological behaviour which is probably due to intrinsic differences. It should be taken into account that 7 amino acid changes were found in the envelope protein which may have affected the expression of some biological properties.